english türkçe
MLPA

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) tek bir nüklotid değişikliği olan dizilerin dahi ayrımını sağlayacak şekilde, 50 kadar farklı genomik DNA veya RNA dizisindeki normal olmayan kopya sayısının tespitini sağlayan bir multipleks PCR yöntemidir.

MLPA tekniği, kullanımı kolay ve birçok laboratuvarda uygulanması mümkün olan bir tekniktir. MPLA çalışması için sadece bir termalcycler ve kapiler elektroforez cihazına ihtiyaç duyulur. Aynı anda 96 numuneyi 24 saat içinde sonuç alacak şekilde işleme tabi tutmak mümkündür.

Gen delesyon (parsiyel) ve duplikasyonları, bir çok kalıtsal hastalığa sebep olan tüm mutasyonların içerisinde %10’dan daha az bir paya sahipken, diğer bir çok hastalık içinse bu oran %10-30 aralığında veya daha yüksektir.

MLPA’nın getirdiği avantajlar

MLPA, kopya sayısı belirlenmesi konusunda diğer tekniklere karşın bir çok avantaj sunmaktadır. Her şeyden önce, nokta mutasyonların belirlenmesi için daha önce geliştirilmiş dizi analizi (sekans) ve DHPLC gibi yöntemler, genellikle kopya sayısı değişikliği tespitinde başarısız kalmaktadır.

İyi karakterize edilmiş delesyon ve amplifikasyonlar PCR ile belirlenebilse de, çoğunlukla delesyonların tam kırılma noktaları bilinmemektedir. Dahası, MLPA’yı FISH ile karşılaştırdığımızda, MLPA sadece multipleks bir teknik olduğu için değil, aynı zamanda çok kısa diziler (50-70 nt) hedeflendiğinden, küçük olduğu için FISH ile tespiti mümkün olmayan sık tek gen değişiklerinin belirlenebilmesi sağlaması bakımından avantaj sunmaktadır.

Ayrıca, MLPA saflaştırılmış DNA üzerinden çalışılmaktadır. Son olarak “Array CGH” ile karşılaştırdığımızda, MPLA daha az maliyetli ve daha az karmaşık bir yöntemdir. MLPA tüm genomu hedefleyen araştırma taramaları için uygun olmamakla birlikte, birçok rutin uygulama için“array” tabanlı tekniklere iyi bir alternatiftir.

Bugün, göreceli olarak sık rastlanan (Duchenne, DiGeorge sendromu, SMA) hastalıklardan daha nadir görülenlerine (hereditary pancreatitis, Antithrombin deficiency, Birt-Hogg-Dube sendromu) kadar 300’ün üzerinde prob seti kullanıma hazır olarak piyasaya sunulmuştur.

MLPA Reaksiyonu

MPLA için tipik olan hedeflenen dizilerin değil, MLPA problarının hedef diziyle hibridizasyonun çoğaltılmasıdır. Standart multipleks PCR’a karşın, MPLA amplifikasyonu için bir çift PCR primeri kullanılır. SALSA MLPA kiti ile amplifiye edilen ürünler 130 ile 480 nt arasındaki uzunluklarda değişir ve kapiler elektroforez ile analizi yapılabilir. Elde edilen tepe paterninin referans örnek ile karşılaştırılması hangi dizilerin normal olmayan kopya sayısını gösterdiğini belirler.

MLPA reaksiyonunu beş safhaya ayırılabilir ;

  1. DNA denaturasyonu ve MLPA problarının hibridizasyonu
  2. ligasyon (bağlanma) reaksiyonu,
  3. PCR reaksiyonu,
  4. Amplifiye ürünün elektroforez ile ayrıştırılması,
  5. Veri analizi,

Birinci safhada DNA denature edilir ve MPLA prob karışımı ile gece inkübasyonuna bırakılır. MLPA probları, her biri PCR primer dizilerinden birini içeren iki farklı oligonükleotidden oluşur. Bu iki prob tamamen komşu dizilere hybridize olur (Şekil 1-Adım1).

Ligasyon aşamasında sadece birbirine komşu hedeflere hybridize olmuş iki probun bağlanması gerçekleşir (Şekil 1-Adım2).

PCR reaksiyonu sırasında sadece bağlı problar çoğaltılacağından (Şekil 1- Adım3), prob bağlı ürünün sayısı, örnekteki hedef dizi sayısı için bir ölçü teşkil eder.

Kapiler elektroforez kullanılarak çoğaltılmış ürünler ayrıştırılır (Şekil 1-Adım4). Bağlanmamış prob oligonüklotidler bir primer dizisi içerirler.

Sonuç olarak, bunlar eksponansiyel olarak çoğaltılmaz ve bir işaret de üretemezler. MLPA yönteminde, bu yüzden bağlanmamış probların bertarafı gereksizdir ve bu da yöntemin uygulanmasını kolaylaştırır.

Copyright © 2009 İnvitrotek Ltd. Şti. All Right Reserved Invitrotek
Powered by EOS